摘要
BHK-21細(xì)胞是世界衛(wèi)生組織推薦的生產(chǎn)獸用疫苗的細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于多種病毒的增殖，該細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)已有半個多世紀(jì)的歷史，如今已成為生產(chǎn)口蹄疫疫苗最普遍的手段。但目前所廣泛采用的生產(chǎn)工藝遠(yuǎn)未能滿足市場的需求，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)效率是目前口蹄疫疫苗反應(yīng)器規(guī)模生產(chǎn)的研究熱點。細(xì)胞懸浮馴化、個性化培養(yǎng)基開發(fā)以及反應(yīng)器疫苗生產(chǎn)和純化工藝是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究針對上述的關(guān)鍵技術(shù)開展了相關(guān)實驗，為建立高效的生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)。
前言
口蹄疫（Foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒感染引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，主要為偶蹄動物易感。它流行廣、傳播快、發(fā)病率高，可通過多種途徑快速遠(yuǎn)距離傳播，危害極大。BHK-21細(xì)胞即幼倉鼠腎細(xì)胞（Baby Hamster Kidney cell），已被廣泛應(yīng)用于多種病毒的增殖及獸用疫苗的生產(chǎn)。該細(xì)胞易于馴化成懸浮培養(yǎng)，方便進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增，提高產(chǎn)量。同時，該細(xì)胞也是口蹄疫病毒的理想宿主，能夠維持病毒的穩(wěn)定擴(kuò)增?？谔阋咦鳛锳類動物傳染病，一旦爆發(fā)疫情，將對國民經(jīng)濟(jì)造成巨大影響，接種疫苗是預(yù)防該病最有效的方法。隨著BHK-21細(xì)胞懸浮生產(chǎn)工藝的應(yīng)用，國內(nèi)口蹄疫疫苗的生產(chǎn)取得了巨大的進(jìn)步。然而，當(dāng)前我國的防控形勢仍然嚴(yán)峻，現(xiàn)有的生產(chǎn)水平仍存在諸如需要添加血清，工藝流程繁瑣，病毒產(chǎn)量及收率較低等一系列問題，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。不斷優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)效率，仍是相關(guān)疫苗生產(chǎn)企業(yè)的迫切訴求，高效的口蹄疫生產(chǎn)工藝研究具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值和廣闊的市場前景。
實驗設(shè)計
首先，利用本公司自主開發(fā)的無血清培養(yǎng)基B301，懸浮馴化了一株對口蹄疫病毒敏感的BHK-21細(xì)胞。其次，采用單一變量對照的方法，以病毒146S為判定指標(biāo)，對O型MYA98株進(jìn)行了接毒方式、收毒時間以及接毒比例等條件優(yōu)化，初步建立了病毒生產(chǎn)工藝。最后，對病毒收獲提純工藝進(jìn)行優(yōu)化，自主開發(fā)篩選純化助劑，提升病毒回收率。
結(jié)果
BHK-21細(xì)胞無血清懸浮馴化結(jié)果
將貼壁培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，胰酶消化后用含2%血清的B301培養(yǎng)基重懸，以1×106 cells/mL的密度接種于搖瓶，每隔48h傳代，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后逐步降低血清含量，直至無血清培養(yǎng)。結(jié)果如圖1A所示，細(xì)胞連續(xù)傳代生長穩(wěn)定。將馴化完全的細(xì)胞以1×106 cells/mL的密度分別接種于搖瓶和10L反應(yīng)器進(jìn)行批培養(yǎng)，細(xì)胞最大密度可達(dá)8×106 cells/mL以上，反應(yīng)器中密度略高于搖瓶（圖1B）。
不同接毒方式對比結(jié)果
分別在細(xì)胞接種后36h和48h直接接種病毒，同時在細(xì)胞接種后48h進(jìn)行換液和稀釋后接種病毒，對比產(chǎn)毒146S情況如圖2所示。綜合考量了培養(yǎng)基營養(yǎng)供給、細(xì)胞生長狀態(tài)及代謝副產(chǎn)物對產(chǎn)毒的影響，結(jié)果顯示48h換液接毒產(chǎn)毒最高，但相比36h直接接毒提升有限，考慮到大規(guī)模生產(chǎn)中換液操作過程繁瑣，耗時耗能，故采用36h直接接毒的方式，節(jié)省成本。
接毒比例及收毒時間優(yōu)化結(jié)果
細(xì)胞生長36h至密度3.5×106 cells/mL，分別按照1‰、3‰和1%的比例接種病毒，接毒后細(xì)胞活率及產(chǎn)毒146S變化規(guī)律基本一致（圖3），均在接毒后10h-12h，細(xì)胞80%-90%病變死亡時產(chǎn)毒146S最高，其中3‰的接毒比例最佳，146S可達(dá)6 ug/mL。
純化助劑篩選優(yōu)化結(jié)果
分別在收獲病毒液中加入純化助劑PFA、PFB以及兩者組合，并設(shè)置不添加純化助劑的空白對照，作用后經(jīng)離心、深層過濾和中空纖維柱10倍濃縮，檢測回收146S并計算回收率，結(jié)果如圖4所示。添加PFA和PFB的組合回收率最高，可達(dá)90%以上，相比于空白對照提升近一倍。
總結(jié)
懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒疫苗是目前國內(nèi)外口蹄疫生產(chǎn)廠家采用的主流技術(shù)，然而國內(nèi)多數(shù)企業(yè)使用的是低血清培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至合適密度時部分換液成無血清培養(yǎng)基并接毒的生產(chǎn)方式，該工藝操作繁瑣，產(chǎn)量偏低，而且造成了培養(yǎng)基和能耗等不必要的浪費，無形中增加了生產(chǎn)成本。優(yōu)化改進(jìn)現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)量并降低成本，是生產(chǎn)廠家迫切的需求。
細(xì)胞的懸浮馴化和無血清培養(yǎng)一直是動物疫苗生產(chǎn)中的難點，需要長期的技術(shù)積累。得益于本公司完備的細(xì)胞馴化和培養(yǎng)基開發(fā)平臺，以及前期實踐的積累，本研究成功的將一株對口蹄疫病毒敏感的BHK-21細(xì)胞馴化為無血清懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞實現(xiàn)每培養(yǎng)48h穩(wěn)定1:5傳代，可滿足擴(kuò)大生產(chǎn)的需求。
產(chǎn)毒工藝決定了細(xì)胞株和培養(yǎng)基能否發(fā)揮出其最大的潛能，一套高效的產(chǎn)毒工藝往往能取得事半功倍的效果。本研究以病毒146S作為判定指標(biāo)，優(yōu)化了該株BHK-21細(xì)胞的產(chǎn)毒工藝。由于該株BHK-21細(xì)胞的特性和無血清培養(yǎng)的優(yōu)勢，細(xì)胞在生長過程中的能量利用效率較高，且代謝副產(chǎn)物較少，接毒時無需進(jìn)行換液或補(bǔ)料，直接接種病毒即可，大大地簡化了生產(chǎn)流程，提高生產(chǎn)效率。優(yōu)化后最佳接毒方式為細(xì)胞接種后36h直接接毒，細(xì)胞密度在3.5×106 cells/mL左右，接毒比例為3‰，收毒時間為接毒后10-12h。
病毒的收獲和純化也是口蹄疫疫苗生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于病毒收獲液中含有大量的細(xì)胞碎片、核酸以及雜蛋白等，如果不經(jīng)純化除雜而直接制備成疫苗，注射到動物體內(nèi)容易引起一系列的不良反應(yīng)。而口蹄疫病毒的不穩(wěn)定性使其在過程中易裂解失活，也增加了收獲和純化的難度。本研究篩選出兩種純化試劑并進(jìn)行組合應(yīng)用，大幅減少了病毒在離心、過濾和濃縮過程中的損失，將回收率提升近一倍，節(jié)約了生產(chǎn)成本同時提升了生產(chǎn)效率。
