久久婷婷五月综合色首页_亚洲成a人片77777在线播放_又黄又硬又爽又色视频_野狼第一精品社区

        使用本公司研發(fā)的個性化培養(yǎng)基對雞肝癌細胞（LMH細胞）多代次的懸浮傳代培養(yǎng)，考察細胞生長和FAdV-4擴增的穩(wěn)定性。進一步采用單因素實驗法檢測病毒感染復數(shù)（MOI）、培養(yǎng)液稀釋比例等工藝參數(shù)對病毒效價的影響。建立了LMH細胞懸浮培養(yǎng)擴增FAdV-4的生產(chǎn)工藝，操作簡便，易于放大，為當前FAdV-4C疫苗的滾瓶生產(chǎn)工藝替代成大規(guī)模的反應器生產(chǎn)工藝奠定了基礎。

      Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年齡段家禽均易感，在我國雞群中發(fā)病率較高，全國范圍內(nèi)均有流行，并且2010年后逐年上升趨勢。Ⅰ群禽腺病毒的宿主范圍越來越廣，白羽肉雞、肉種雞、蛋雞、黃羽雞均可感染發(fā)病。FAdV-4C屬于Ⅰ群禽腺病毒，能引起的心包積水肝炎綜合征(HHS)，導致產(chǎn)蛋下降甚至死亡(死亡率在20％～80％)。主要病理變化是心包腔中有淡黃色清亮的積液，肝臟腫大、蒼白，腎臟腫大，心臟和肝臟出現(xiàn)多發(fā)性局灶性壞死，肝細胞中見核內(nèi)包涵體。FAdV-4C對雛雞的致病力最強，可通過接觸水平傳播及垂直傳播，對我國養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。

      LMH細胞（雞肝癌細胞）對禽腺病毒病毒敏感性較高，成為腺病毒疫苗生產(chǎn)的最佳宿主之一。在我國，LMH細胞培養(yǎng)以貼壁細胞培養(yǎng)為主，操作繁瑣且需要使用高比例進口血清，成本較高和批間質(zhì)量不穩(wěn)定等問題突出。乃至無血清的懸浮培養(yǎng)工藝則更具優(yōu)勢。然而，疫苗生產(chǎn)用的懸浮LMH細胞的傳代穩(wěn)定性尚未探明，LMH細胞懸浮適應后的產(chǎn)毒能力及相應的工藝也需要詳細的實驗研究。

      本文采用高產(chǎn)株的LMH懸浮細胞株作為出發(fā)細胞株，應用自主研發(fā)的培養(yǎng)基對其傳代培養(yǎng)8個月，考察其在懸浮培養(yǎng)中生長的穩(wěn)定性，并在搖瓶中建立病毒Ⅰ群禽腺病毒擴增工藝。

將生長無異常的懸浮LMH細胞按照接種密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml，每三天（72h）稀釋傳代，37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)傳代中考察細胞生長的穩(wěn)定性。在搖瓶建立接毒工藝并優(yōu)化MOI和稀釋比例等工藝參數(shù)。

     搖瓶連續(xù)傳代累計240天，細胞形態(tài)保持良好，表面光滑圓潤，均呈大小均一的球形，稍有結團，每代次培養(yǎng)72h的細胞密度均可達到5.0~7.0×10⁶ cells/ml，表明該培養(yǎng)體系的傳代培養(yǎng)穩(wěn)定性較好，細胞培養(yǎng)狀態(tài)如圖1，傳代200多天后的細胞生長曲線如圖2。

圖1  培養(yǎng)72h細胞狀態(tài)圖

 圖2  LMH細胞生長增殖表

    MOI

    接種密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml培養(yǎng)72h稀釋接毒，置于37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)，相同稀釋比例（即接毒密度）以不同的MOI進行接毒，每24h取樣計數(shù)觀察，留樣檢測TCID₅₀/ml效價，結果顯示（圖3）。MOI越低，接種病毒后所能達到的最高TCID₅₀效價（TCID₅₀max）出現(xiàn)時間越晚；相反，MOI越高，TCID₅₀max出現(xiàn)時間越早。MOI為0.5和1.0時，HAmax均在接毒72~96h較高，其中實驗組基本均可達9.0lgTCID₅₀/ml以上，最高達到9.5lgTCID₅₀/ml。

圖3  不同MOI下，F(xiàn)AdV-4在LMH細胞中的增殖效果

     接種密度1.0~1.2×10⁶ cells/ml培養(yǎng)72h稀釋接毒，置于37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)，相同的MOI=1.0下以不同的接毒密度（即稀釋比例）接毒，每24h進行取樣計數(shù)觀察，并留樣檢測TCID₅₀，結果顯示（圖4）。接毒密度越低，接種病毒后所能達到的最高TCID₅₀效價（TCID₅₀max）出現(xiàn)越早，反之，接種密度越高，TCID₅₀max出現(xiàn)時間越晚，其中實驗組基本均可達9.0lgTCID₅₀/ml以上，最高達到9.33lgTCID₅₀/ml。

圖4 不同接毒密度下，F(xiàn)AdV-4在LMH細胞中的增殖

        本研究表明本公司實驗室馴化的LMH懸浮細胞在配套的個性化培養(yǎng)基中累計傳代培養(yǎng)240天效果良好，其傳代培養(yǎng)穩(wěn)定，且細胞各代次細胞形態(tài)良好，表面光滑圓潤，72h細胞計數(shù)可達5.0~7.0×10⁶ cells/ml；同時在最佳的接毒條件下（即最佳接毒比例或MOI），接種貼壁培養(yǎng)制備種毒(效價為7.8~8.3lgTCID₅₀/ml)最高效價為9.50lgTCID₅₀/mL，且本研究建立的懸浮培養(yǎng)體系在中試反應器懸浮培養(yǎng)放大生產(chǎn)中已經(jīng)得到了初步的實踐論證，為后續(xù)的大規(guī)模批次生產(chǎn)提供了技術思路與支持。