近幾十年來的研究創(chuàng)新為 mRNA 作為新興疫苗技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)疫苗平臺相比，基于 mRNA 的疫苗開發(fā)相對于其它類型疫苗的加速得益于其簡單的生產(chǎn)過程和安全性。首先，mRNA 不構(gòu)成插入誘變的風(fēng)險。它是非感染性的，并在細(xì)胞內(nèi)自然降解。其次，可以通過修飾和各種遞送方法使 mRNA 更加穩(wěn)定，使其在宿主細(xì)胞中高效且易于翻譯。此外，可以使用體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) 反應(yīng)在無細(xì)胞系統(tǒng)中制備 mRNA，與傳統(tǒng)的基于細(xì)胞的疫苗平臺相比，該技術(shù)更易于生產(chǎn)和調(diào)節(jié)。最后，mRNA 生產(chǎn)可以應(yīng)用于使用類似生物過程的各種抗原，使該技術(shù)易于適應(yīng)和更加通用。
最近的 COVID-19 大流行凸顯了擁有隨時可用的疫苗平臺以應(yīng)對新興流行病的重要性。為了應(yīng)對大流行，mRNA 技術(shù)是第一個作為 COVID-19 治療藥物進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)的候選疫苗，疫苗的臨床試驗(yàn)在序列鑒定后兩個月開始。因此，mRNA 技術(shù)被帶到了疫苗療法研究和開發(fā)的前沿。強(qiáng)調(diào)使用 mRNA 疫苗治療當(dāng)前和新出現(xiàn)的疾病的前瞻性研究已經(jīng)推動許多候選疫苗進(jìn)入各種傳染病的臨床試驗(yàn)。因此，由于新型 mRNA 疫苗技術(shù)帶來的好處和靈活性，人們越來越有興趣在未來幾年推進(jìn)其工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。這將涉及增強(qiáng)和優(yōu)化 mRNA 生物工藝，以適應(yīng)各種抗原平臺。
本綜述將概述 mRNA 疫苗的設(shè)計和 mRNA 疫苗平臺的當(dāng)前技術(shù)發(fā)展。此外，文章將側(cè)重于疫苗設(shè)計、生產(chǎn)和當(dāng)前實(shí)施的關(guān)鍵質(zhì)量屬性范例，以實(shí)現(xiàn)高規(guī)格 mRNA 疫苗生產(chǎn)的創(chuàng)新。最后，將討論 PAT 集成的生物制藥生產(chǎn)的未來方向和發(fā)展。
作為疫苗的 mRNA 的進(jìn)化
1989 年，一項開創(chuàng)性的研究證明了使用脂質(zhì)體進(jìn)行 RNA 轉(zhuǎn)染可生產(chǎn)蛋白質(zhì)。不久之后，另一項研究表明，將裸露的 mRNA 注入小鼠肌肉細(xì)胞會導(dǎo)致編碼蛋白在體內(nèi)表達(dá)。這些研究確立了使用體外轉(zhuǎn)錄的 mRNA 在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的可行性。然而，盡管有這些有希望的發(fā)現(xiàn)，但由于對 mRNA 穩(wěn)定性和翻譯效率的擔(dān)憂，使用 RNA 作為治療工具面臨著幾個重大挑戰(zhàn)。因此，它并沒有立即被認(rèn)為是一種可行的治療選擇。
直到 2000 年代初，修飾核苷酸的技術(shù)突破和遞送方法的進(jìn)步才為 mRNA 作為潛在治療藥物鋪平了道路。許多創(chuàng)新，例如使用修飾的核苷酸、特定密碼子序列以及使用高效液相色譜 (HPLC) 消除雙鏈 RNA 污染物，有助于提高 mRNA 的穩(wěn)定性，并減輕不需要的免疫原性反應(yīng)，從而推動了 mRNA 疫苗的開發(fā)。此外，細(xì)胞質(zhì) mRNA 遞送的效率也因各種遞送方法而發(fā)生了革命性變化，包括使用脂質(zhì)納米顆粒 (LNP)。
mRNA抗原的類型
通過體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) 產(chǎn)生的 mRNA 抗原的結(jié)構(gòu)與成熟的真核 mRNA 非常相似。它們包含一個編碼目標(biāo)抗原的開放閱讀框 (ORF)，兩側(cè)是 5' 和 3' 非翻譯區(qū) (UTR) 和一個 5' 引物帽結(jié)構(gòu)，以及一個 3' poly(A) 尾部。目前，已經(jīng)評估了兩種類型的 mRNA 抗原構(gòu)建體：非復(fù)制和自我擴(kuò)增的 mRNA 抗原。兩者的結(jié)構(gòu)相似，除了自我復(fù)制型 mRNA 還包括通常來自單鏈 RNA 病毒的病毒復(fù)制酶基因（圖 1）。非復(fù)制性 mRNA 抗原由于其 RNA 長度較短和直接抗原表達(dá)而更容易生產(chǎn)。然而，由于其表達(dá)時間較短，它可能需要更高的劑量才能產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。自擴(kuò)增 mRNA 抗原可以緩解這個問題，因?yàn)樗鼣y帶病毒復(fù)制酶基因，以增強(qiáng) mRNA 表達(dá)持續(xù)時間。然而，由于較長的 RNA 轉(zhuǎn)錄本長度和自我擴(kuò)增的潛在免疫反應(yīng)，目前在生產(chǎn)和優(yōu)化此類抗原方面仍存在挑戰(zhàn)。研究人員目前正在探索優(yōu)化 mRNA 抗原表達(dá)和穩(wěn)定性的策略。
圖1：使用非復(fù)制mRNA和自擴(kuò)增mRNA表達(dá)抗原的簡化示意圖。同樣，非復(fù)制和自我擴(kuò)增的RNA都可以用脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 包裹，以促進(jìn)細(xì)胞攝取，并防止mRNA降解。非復(fù)制的mRNA結(jié)構(gòu)體在細(xì)胞質(zhì)中被翻譯，以產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，此外，自擴(kuò)增的mRNA也被翻譯，以產(chǎn)生復(fù)制酶機(jī)制，用于擴(kuò)增目標(biāo)蛋白質(zhì)。所得抗原蛋白以跨膜或細(xì)胞內(nèi)蛋白的形式產(chǎn)生，用于刺激免疫反應(yīng)。
優(yōu)化 mRNA 抗原效率
設(shè)計有效的 mRNA 候選疫苗需要仔細(xì)考慮許多工藝屬性。最近的進(jìn)展創(chuàng)造了改造 mRNA 技術(shù)以創(chuàng)造更適合的 mRNA 疫苗抗原的機(jī)會。對于 mRNA 疫苗，有兩個主要成分：mRNA（抗原）（圖 2）和脂質(zhì)納米顆粒（遞送系統(tǒng)）。這兩個組成部分都需要進(jìn)行監(jiān)管，以確保高質(zhì)量的疫苗生產(chǎn)。
圖2：mRNA抗原設(shè)計的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。影響轉(zhuǎn)錄質(zhì)量、效率和穩(wěn)定性的mRNA抗原屬性包括[1]5' 帽、[2]非翻譯區(qū)、[3]編碼序列、[4]3' Poly(A) 尾、[5]mRNA純度。
mRNA 5'帽：該帽是mRNA抗原的重要組成部分，在調(diào)節(jié)翻譯起始和免疫原性中起重要作用。有兩種常見的帽狀結(jié)構(gòu)：cap O，由甲基-7鳥嘌呤核苷酸通過5'三磷酸連接到5' 位置；cap 1，涉及核糖2'-O位置的mRNA首核苷酸甲基化。這些帽通過防止外切酶降解來穩(wěn)定mRNA轉(zhuǎn)錄物，并提供有效的翻譯起始位點(diǎn)來招募核糖體。此外，加帽mRNA有助于防止先天免疫反應(yīng)的過度激活。有幾種方法可以將5'帽添加到mRNA轉(zhuǎn)錄物上。一種方法是在IVT反應(yīng)中使用合成的帽類似物，而另一種方法涉及使用CleanCap?方法將cap 1結(jié)構(gòu)添加到特定的轉(zhuǎn)錄起始序列。加帽也可以使用牛痘加帽系統(tǒng)作為酶促反應(yīng)來完成。這些方法確保了對mRNA抗原的有效和精確的5'加帽，這對于開發(fā)有效的疫苗至關(guān)重要。
mRNA 5'和3'非翻譯區(qū)(UTR's)：5'和3'非翻譯區(qū)分別對翻譯效率和mRNA穩(wěn)定性至關(guān)重要。優(yōu)化的序列特異性富集UTR可以通過影響翻譯機(jī)器識別、招募和mRNA運(yùn)輸來促進(jìn)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。優(yōu)化可以通過調(diào)整3'和5' UTR的長度來實(shí)現(xiàn)，或者使用特定的核苷酸富集 (例如，5' UTR Kozak序列用于翻譯效率，3' UTR au豐富元件用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性)。選擇基于其它天然穩(wěn)定表達(dá)較長的mRNA分子的UTR也有助于提高mRNA的翻譯效率和轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性。
抗原編碼序列：為了豐富抗原表達(dá)，目前使用密碼子優(yōu)化和組成來提高轉(zhuǎn)錄效率(如GC含量)。此外，修飾的核苷酸，包括甲基化核苷和假尿嘧啶，可以幫助保護(hù)mRNA免受強(qiáng)烈的免疫刺激反應(yīng)，增加mRNA的穩(wěn)定性，允許更長的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)，并提高疫苗的安全性。
mRNA 3' Poly(A) 尾：3' Poly(A) 尾通過保護(hù)序列免受核酸酶降解和為Poly(A) 結(jié)合蛋白結(jié)合提供位點(diǎn)，對mRNA的穩(wěn)定性很重要。Poly(A) 尾的最佳長度取決于細(xì)胞類型，必須仔細(xì)優(yōu)化以提供最大的穩(wěn)定性。研究表明，poly(A) 尾的長度與mRNA表達(dá)的持續(xù)時間之間存在相關(guān)性。添加poly(A) 尾的主要方法有兩種。第一種方法是將poly(A) 編碼序列直接添加到用于IVT的DNA模板中。第二種是使用單獨(dú)的酶促反應(yīng)，利用聚A聚合酶。poly (A) 尾的優(yōu)化對于確保mRNA轉(zhuǎn)錄物保持完整和功能至關(guān)重要，從而提供安全有效的候選疫苗。
mRNA純度：mRNA純度是一項關(guān)鍵的質(zhì)量屬性，必須仔細(xì)控制，以確保疫苗效力和最佳免疫反應(yīng)。RNA污染物激活觸發(fā)mRNA降解和抑制翻譯的免疫反應(yīng)。dsRNA污染物是IVT期間異常聚合酶活性產(chǎn)生的雜質(zhì)的一種形式。為了減輕這種情況的發(fā)生，使用HPLC純化IVT mRNA有助于去除dsRNA，增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量，同時減少不必要的免疫激活。
脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 遞送mRNA疫苗的優(yōu)化：為了確保mRNA疫苗的有效性，需要將抗原正確遞送到細(xì)胞中，以表達(dá)目的蛋白質(zhì)。雖然裸mRNA可以在不同的細(xì)胞類型中整合和表達(dá)，但最佳表達(dá)需要一種遞送機(jī)制。這不僅有助于正確地遞送mRNA，以產(chǎn)生抗原，而且還保護(hù)其免受核酸酶的降解。在各種遞送系統(tǒng)中，目前LNP已廣泛用于疫苗開發(fā)，包括COVID-19 mRNA疫苗。大多數(shù)LNP配方含有陽離子或電離脂質(zhì)以及磷脂、膽固醇和聚乙二醇(PEG)脂質(zhì)。每種類型的脂質(zhì)在調(diào)節(jié)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中mRNA抗原顆粒的穩(wěn)定性、有效性和生物分布方面發(fā)揮著不同的作用，可電離脂質(zhì)有助于內(nèi)體從中性pH值轉(zhuǎn)換為酸性pH值，這對于細(xì)胞攝取后mRNA的釋放很重要。其它脂質(zhì)，包括磷脂，如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3磷脂膽堿 (DSC)和DOPE，有助于穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)，并有助于脂質(zhì)納米顆粒的內(nèi)體釋放。此外，膽固醇促進(jìn)LNP結(jié)構(gòu)的完整性，從而促進(jìn)細(xì)胞有效攝取。最后，聚乙二醇化脂質(zhì)通過延長納米顆粒在血液中的循環(huán)，以促進(jìn)細(xì)胞攝取和減少聚集，從而增強(qiáng)LNP的穩(wěn)定性。因此，mRNA和LNP遞送系統(tǒng)的屬性和成分在mRNA疫苗產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中是調(diào)節(jié)和控制抗原產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵考慮因素。
mRNA生產(chǎn)的演變和未來展望
mRNA疫苗生產(chǎn)概述
目前的mRNA生產(chǎn)過程可分為三個不同的階段：1- mRNA活性物質(zhì)的生產(chǎn)，2- RNA-LNP的配制，3-終產(chǎn)品的生產(chǎn)。
圖3：mRNA疫苗生產(chǎn)的主要工藝階段概述：1-mRNA活性物質(zhì)的生產(chǎn)，2-RNA-脂質(zhì)納米顆粒的制劑，3-終產(chǎn)品的生產(chǎn)。
階段 1： mRNA 活性物質(zhì)的產(chǎn)生
上游 mRNA 平臺過程通常涉及使用大腸桿菌發(fā)酵從質(zhì)粒中產(chǎn)生 DNA 模板。使用限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒線性化并用于 IVT 反應(yīng)，其中包含 NTP、緩沖液、MgCl2 以及 T7、SP6 或 T3 RNA 聚合酶，以在體外轉(zhuǎn)錄 mRNA。轉(zhuǎn)錄后修飾，包括 5' 加帽和 3' Poly (A) 尾添加，通常在 mRNA 合成后進(jìn)行。使用 DNase 消化任何剩余的 DNA 模板。當(dāng)前使用 CleanCap? 或帽類似物的加帽技術(shù)創(chuàng)新可以簡化反應(yīng)過程，并在 IVT 反應(yīng)期間完成 5' 加帽，同時添加由模板 DNA 編碼的 Poly(A) 尾。
IVT 反應(yīng)后，必須從反應(yīng)混合物中純化 mRNA，因?yàn)樵S多雜質(zhì)包括酶、殘留的 NTP、殘留的 DNA 和來自提前中止反應(yīng)的短 RNA，而雙鏈 RNA (dsRNA) 會刺激不需要的免疫反應(yīng)并降低產(chǎn)品安全性。雖然目前還沒有基于法規(guī)要求的標(biāo)準(zhǔn)化純化方法，但目前各種mRNA抗原平臺采用多種純化和過濾方法。純化技術(shù)，例如尺寸排阻層析 (SEC)、離子對反相層析 (IPC)、離子交換層析 (IEC)、脫氧胸苷 (dT) – Oligo dT 親和層析、羥基磷灰石或疏水相互作用、多模式或基于纖維素的層析法。此外，切向流過濾 (TFF) 也可用于去除雜質(zhì)，同時進(jìn)行濃縮和溶液洗濾，使其成為大規(guī)模生產(chǎn)的通用過濾方法。 TFF 通常與 mRNA 沉淀結(jié)合使用，這樣可以保留 mRNA，同時通過洗濾去除雜質(zhì)。常見的 IVT 純化方案通常結(jié)合使用 TFF，然后是層析步驟和第二個 TFF，以正確純化 mRNA，去除工藝污染物，并促進(jìn)濃縮和緩沖液置換。
階段 2 和 3： RNA-LNP 的配制和終產(chǎn)品生產(chǎn)
mRNA產(chǎn)物制備完成后，進(jìn)行LNP配制和包封，組裝疫苗抗原。這是通過使用微流控或基于噴射的快速混合技術(shù)，將在水性緩沖液中的 mRNA 和在乙醇中的脂質(zhì)混合來實(shí)現(xiàn)的。然后使用 TFF 和除菌過濾純化載有 mRNA 的 LNP，用于第3階段的最終灌裝。在此階段，將除菌過濾和稀釋的 mRNA 疫苗添加到適當(dāng)?shù)男∑恐?，加蓋并密封，以進(jìn)行最終藥物產(chǎn)品包裝。
mRNA 疫苗質(zhì)量源于設(shè)計 (QBD) 框架
要為 mRNA 疫苗設(shè)計有效的生產(chǎn)工藝，重要的是定義關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 并了解生產(chǎn)高質(zhì)量抗原所需的檢測類型。這種方法可以提供一個路線圖，根據(jù)有關(guān)當(dāng)前生產(chǎn)疫苗的技術(shù)和監(jiān)管要求的先驗(yàn)知識來優(yōu)化生產(chǎn)實(shí)踐，以調(diào)節(jié) mRNA 抗原的質(zhì)量，確保產(chǎn)品的效率、效力和安全性以及預(yù)期的免疫效果。
從 mRNA 疫苗活性物質(zhì)到最終藥物產(chǎn)品，需要考慮各種 COA。例如，與 dsRNA 和 mRNA 結(jié)構(gòu)元素（包括 5' 帽和 3' poly-(A) 尾）相關(guān)的質(zhì)量屬性對于檢測和調(diào)節(jié)很重要，因?yàn)樗鼈儠绊懠?xì)胞免疫反應(yīng)、翻譯效率和轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性。同樣，對于 LNP 配制，了解顆粒大小、電荷和脂質(zhì)含量對于優(yōu)化藥物產(chǎn)品功效和細(xì)胞免疫反應(yīng)至關(guān)重要。因此，生產(chǎn)框架的設(shè)計需要整合質(zhì)量屬性和預(yù)期質(zhì)量結(jié)果，以確定在整個生產(chǎn)過程中監(jiān)控所需的 CQA。
mRNA 疫苗的生產(chǎn)工藝設(shè)計需要全面了解質(zhì)量屬性和關(guān)鍵工藝參數(shù)之間的關(guān)系，以確保最終藥品的質(zhì)量。首先要了解 mRNA 疫苗設(shè)計、可能影響疫苗質(zhì)量的上游和下游工藝。例如，加帽機(jī)制等上游工藝可能需要額外的純化步驟，這可能會影響抗原產(chǎn)量。監(jiān)測 IVT 反應(yīng)時間和溫度有助于優(yōu)化 mRNA 產(chǎn)量，同時保持轉(zhuǎn)錄本的質(zhì)量。檢測這些參數(shù)對于確保 mRNA 疫苗抗原質(zhì)量，以避免產(chǎn)品雜質(zhì)（包括 dsRNA 顆粒污染物）非常重要。
下游工藝對于防止 mRNA 變性和沉淀很重要。例如，需要優(yōu)化與 TFF 結(jié)合的商業(yè)規(guī)模層析方法的選擇，以確定 RNA 截留和純化的最佳條件，同時保持 mRNA 質(zhì)量。此外，LNP 形成技術(shù)（包括混合率）會影響 mRNA 封裝和 LNP 顆粒完整性。目前，由于純化技術(shù)和表征工具之間缺乏明確的調(diào)節(jié)或優(yōu)化方法來監(jiān)測抗原產(chǎn)量，因此 mRNA 生產(chǎn)仍然存在許多未知的關(guān)鍵工藝參數(shù)。因此，有必要開發(fā)過程分析技術(shù) (PAT) 解決方案，以更好地了解過程參數(shù)，確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量和純度。
用于 mRNA 生產(chǎn)的 PAT 和數(shù)字設(shè)計框架
為了連接關(guān)鍵質(zhì)量屬性和過程控制，可以使用 PAT 開發(fā)分析工具。 PAT 使用數(shù)據(jù)模型創(chuàng)建工具，為工藝優(yōu)化提供有關(guān)質(zhì)量屬性的更多信息，并提供實(shí)時監(jiān)控生物過程的解決方案，從而實(shí)現(xiàn)預(yù)測控制和過程自動化。目前，有許多離線技術(shù)被用于表征基于 mRNA 的疫苗的工藝參數(shù)，包括有關(guān) mRNA 產(chǎn)量、回收率、總含量和結(jié)構(gòu)完整性的信息。然而，有關(guān) mRNA 序列、5' 帽、Poly(A) 尾長度和 RNA 純度的質(zhì)量屬性仍需要額外檢測。此外，有關(guān)藥品純度的信息，包括來自大腸桿菌 DNA 模板生產(chǎn)的 dsRNA 污染物、殘留 DNA、酶和蛋白質(zhì)，對于確保用于封裝的適當(dāng) mRNA 抗原溶液也很重要。最后，mRNA-LNP 顆粒的特征對于表征很重要，包括 RNA 封裝、LNP 大小、穩(wěn)定性、電荷、形態(tài)、脂質(zhì)含量和雜質(zhì)，以確保疫苗將被有效和正確地包裝，以實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)募?xì)胞攝取。因此，質(zhì)量源于設(shè)計 (QBD) 和 PAT 框架的目的和目標(biāo)是設(shè)計能夠使用可適用于數(shù)字化建模和實(shí)時反饋的分析工具測量所有重要工藝參數(shù)和質(zhì)量屬性的過程。
已經(jīng)開發(fā)了各種 PAT 工具來在 mRNA 疫苗生產(chǎn)過程中實(shí)時測量 CQA。例如，可以集成 UV-VIS 光譜法或自動通量圓二色性 (CD) 來監(jiān)測 RNA 完整性和雜質(zhì)。紫外光譜可以應(yīng)用到可用于測量 RNA 濃度的在線技術(shù)中。另一方面，CD 可用于測量 RNA 二級結(jié)構(gòu)。在線動態(tài)光散射 (DLS) 可用于在下游純化過程步驟中測量 LNP 粒徑分布。包括核磁共振 (NMR) 在內(nèi)的其它分析技術(shù)可用于實(shí)時監(jiān)測，以識別脂質(zhì)并量化脂質(zhì)降解和其它特征，包括納米顆粒結(jié)構(gòu)完整性。這些示例共同強(qiáng)調(diào)了開發(fā) PAT 工具的必要性，這些工具可用于實(shí)時過程中監(jiān)控 mRNA 關(guān)鍵質(zhì)量屬性，以更好地理解和控制 mRNA 生產(chǎn)過程。
結(jié)論
對 mRNA 疫苗的需求不斷增加，需要標(biāo)準(zhǔn)化的方法和監(jiān)管框架。它創(chuàng)造了對方法創(chuàng)新的需求，以更好地理解和測量 mRNA 疫苗產(chǎn)量、質(zhì)量和安全概況所需的質(zhì)量屬性?？梢允褂妙愃粕a(chǎn)工藝調(diào)整 mRNA 抗原的多功能性，為開發(fā)可應(yīng)用于未來 mRNA 疫苗抗原平臺數(shù)字生產(chǎn)的 QBD 框架和模型提供了極好的機(jī)會。本文中概述的分析工具的開發(fā)將有助于提高對上游和下游 mRNA 生產(chǎn)過程的了解。這提供了一個框架來幫助轉(zhuǎn)移工藝知識，這些知識可以針對新的疫苗抗原平臺進(jìn)行調(diào)整和擴(kuò)展。此外，PAT 工具的開發(fā)推進(jìn)了工藝的數(shù)字化，并允許過程反饋控制，以優(yōu)化 mRNA 疫苗生產(chǎn)流程。
原文：G.Gerzon, Y.Sheng, M.Kirkitadze, Landscape of mRNA vaccine design and manufacturing technologies. Biopharma-Asia, 2023.
