在過去十年中，單克隆抗體 (mAb) 作為治療各種疾病的高效、靈活的工具獲得了巨大的治療應用。盡管取得了這一成功，但仍有機會通過優(yōu)化成本效益措施，降低基于抗體的療法的生產成本。為了降低生產成本，在過去幾年中實施了基于最先進的補料分批和灌流的新型工藝強化方法。在工藝強化的基礎上，我們在這里介紹一種新穎、創(chuàng)新的混合工藝的可行性和好處，該工藝結合了補料分批操作的穩(wěn)健性和通過流化床離心機 (FBC) 實現的完整培養(yǎng)基置換的好處。在最初的小規(guī)模 FBC 模擬篩選中，我們研究了多個工藝參數，導致細胞增殖提高和活性趨勢延長。隨后，最高產的工藝方案被轉移到 5 L規(guī)模，進一步優(yōu)化并與標準補料分批工藝進行比較。我們的數據表明，在使用與標準補料分批操作相同的反應器尺寸和工藝持續(xù)時間的同時，新型混合工藝可顯著提高峰值細胞密度 (163%) 并將 mAb 量顯著增加約 254%。此外，我們的數據顯示了工藝之間具有可比的關鍵質量屬性 (CQA)，并揭示了規(guī)模放大的可能性，并且無需進行廣泛的額外工藝監(jiān)控。因此，這種新的工藝強化策略具有轉移到未來工業(yè)生產環(huán)境中的巨大潛力。
簡介
重組表達的生物治療藥物，如單克隆抗體 (mAb)、激素、細胞因子和疫苗，近年來在制藥行業(yè)受到極大關注。特別是，自 1986 年首次獲得臨床批準（Orthoclone OKT3?）以來，基于 mAb 的新型療法已成為臨床應用和生物生產的主要興趣點。從那時起，無數的臨床試驗凸顯了這些生物治療藥物的獨特優(yōu)勢，例如靈活調整應用、低毒性、高特異性和合適的體內半衰期。因此，截至今天，超過 100 種基于 mAb 的治療藥物已獲得美國食品和藥物管理局 (FDA) 的批準，還有更多藥物正在臨床開發(fā)中，證明人們對這些生物藥物的興趣仍在增加。
治療性抗體的特點是復雜的翻譯后修飾，以確保蛋白質的生物活性和低毒性。因此，哺乳動物細胞系，如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，被用于表達這些復雜的生物分子，而不是微生物宿主。與小分子療法相比，基于抗體的免疫療法生產成本相當高，導致其價格非常昂貴。為了降低成本，新穎的創(chuàng)新強化策略是必要的。
補料分批 (FB) 等不連續(xù)工藝形式因其穩(wěn)健性、簡單性和可重復性而成為大規(guī)模生產 mAb 的最先進技術。該工藝過程可分為三個連續(xù)的培養(yǎng)階段：細胞呈指數增長的對數期、細胞無生長的穩(wěn)定期和通常由于凋亡細胞數量增加而導致細胞活性下降的死亡期。在防止營養(yǎng)限制的 FB 工藝中，這些不同階段之間的過渡通常由抑制分子（如生長抑制劑、副產物和裂解細胞碎片）的積累觸發(fā)，最終限制了該類工藝的整體生產力和時間跨度。自 1990 年以來，不連續(xù)形式的產品滴度從 0.1 g/L 提高到 5 g/L，主要是通過優(yōu)化細胞系、培養(yǎng)基系統(tǒng)、過程控制以及從批次模式切換到 FB 模式。此外，已經開發(fā)了不同的策略來提高細胞的生產力，例如添加特定分子來提高生產力、增加滲透壓，以及在穩(wěn)定期改變溫度或 pH 值，從而使細胞活性和生產力能夠持續(xù)很長一段時間。然而，不連續(xù)操作的關鍵限制是細胞源性抑制分子的積累以及培養(yǎng)基中的營養(yǎng)限制，這限制了該工藝的單位體積生產率。
為了繞過不連續(xù)工藝形式的不利特征，已經在不間斷的培養(yǎng)基置換的基礎上尋求替代工藝策略。這些灌流細胞培養(yǎng)系統(tǒng)通過置換培養(yǎng)基使細胞進一步增殖，從而去除抑制性分子并提供新鮮營養(yǎng)素。為了不斷去除無細胞培養(yǎng)基部分，開發(fā)了細胞截留裝置，最常見的系統(tǒng)基于交替式切向流 (ATF) 或切向流過濾 (TFF)。通過使用廢棄（bleeding）系統(tǒng)來調節(jié)活細胞濃度，可以達到偽穩(wěn)態(tài)，以防止營養(yǎng)限制和細胞源性分子的濃度，從而允許連續(xù)培養(yǎng)。因此，與不連續(xù)工藝相比，灌流細胞培養(yǎng)能夠提高單位體積生產率和設施利用率。然而，這些連續(xù)培養(yǎng)需要大量的培養(yǎng)基 - 每天多達幾個反應器體積 - 用于細胞截留的大型膜裝置，以及復雜的過程監(jiān)測。這種增加的培養(yǎng)基消耗是灌流工藝中的主要成本驅動因素之一。
所有這些混合工藝都利用過濾系統(tǒng)來連續(xù)置換反應器中的廢培養(yǎng)基。但是，過濾系統(tǒng)顯示出明顯的缺點，例如置換速度慢，這會導致新供應培養(yǎng)基的反向混合以及膜堵塞和污染。該領域的一項新興技術是流化床離心機 (FBC)，它可以從上清液中快速無菌分離細胞，并在溫和的工藝條件下進行洗滌和濃縮。 FBC 的功能原理依賴于抵消離心力和流動力而產生的細胞捕獲，而低分子量顆粒，如廢培養(yǎng)基和 mAb，可以流過。該系統(tǒng)最初是作為細胞澄清設備開發(fā)的，顯示出 mAb 和細胞的高回收率。然而，細胞和培養(yǎng)基的非侵入性 FBC 分離也被假定在上游工藝過程中適用，以允許完整的培養(yǎng)基置換中間工藝。 10 多年前就提出了將洗滌后的細胞返回細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的一般概念，而其中一個概念包括兩個并行運行的生物反應器，其中細胞培養(yǎng)液通過 FBC 系統(tǒng)處理，轉移到第二個生物反應器中，已在 Jacob Arthur Tijsterman（2015 年）的研究中進行了描述。但是，這些工藝概念的概念驗證數據仍然缺失。
在這項工作中，我們提出了一種新的工藝方案，其中僅使用一個生物反應器并應用培養(yǎng)基置換來強化常見的補料分批操作。這種新的強化工藝概念基于 FBC 提供的有益培養(yǎng)基置換，旨在實現更高的單位體積生產率，同時避免過度使用培養(yǎng)基和對廣泛過程控制的需求。這種新工藝基于中間收獲 (Intermediate Harvest) 步驟，在第一個培養(yǎng)階段之后，收獲產品，同時用新鮮培養(yǎng)基清洗細胞，然后返回同一個生產反應器進行第二個生產階段（圖 1）。新的強化工藝在小規(guī)模篩選系統(tǒng)中進行了測試，以研究對培養(yǎng)的影響，并連續(xù)放大和進一步優(yōu)化?？偟膩碚f，應該使用規(guī)?？s小選項開發(fā)一個在生產率和培養(yǎng)基消耗方面具有有益特征的強化工藝。
圖 1. 中間收獲過程的示意圖。含有分泌物的細胞培養(yǎng)液從生物反應器中收集，并通過一次性流化床離心機分離。之后，清洗后的細胞可以重新引入生產生物反應器并用于新工藝。
圖 2. 在不同時間點進行和不進行完全培養(yǎng)基置換的標準補料分批 (std. FB) 培養(yǎng)隨時間推移的培養(yǎng)結果。 (A)、(B) 和 (C) 為在第 6 天（IH d6；n = 3）、第 9 天（IH d9；n = 3), 和第 11 天 (IH d11; n = 2) 進行培養(yǎng)基置換時的活細胞密度（VCC）和活性（Via.）的變化，分別與標準FB (n = 3) 培養(yǎng)相比。培養(yǎng)基置換的各個時間點用虛線表示。 (D) 在整個培養(yǎng)期內所有培養(yǎng)的 IVCC 值。 (E) 每個培養(yǎng)隨時間變化的細胞直徑。
圖 3. 在中間收獲 (IH) 和最終收獲 (EH) 的各個時間點進行的小規(guī)模篩選的上清液分析。 (A) 在小規(guī)模篩選中每種方法的 mAb 累積量。 (B) IH 之前的第一個培養(yǎng)階段和 IH 和 EH (EH) 之間的第二階段的平均細胞特異性生產力。在 EH 之前的整個工藝持續(xù)時間內計算控制 FB 的生產率。 (C) 在 IH 和 EH 的時間點，每種方法的 HCP 含量與表達的 mAb 的比率。
圖 4. IH 操作后從 5 L 反應器轉移到 250 mL 縮小模型的培養(yǎng)結果。 (A) 標準 FB、以 25 × 10^6 cells/mL (IH 25) 重新接種的IH方法以及優(yōu)化的IH工藝（IH opt.）隨時間變化的 VCC（實線）和活性（虛線）曲線。 (B) 所有方法隨時間的細胞直徑變化。 (C) 培養(yǎng)過程中的 mAb 滴度 (g/L)。 (D) 以 pg/c/d 為單位的細胞特異性生產力 (qP)，用于每個進行的實驗的指數和穩(wěn)定階段。
圖 5. 標準 FB (n = 2) 和優(yōu)化 IH 在 UniVessel 培養(yǎng)中的細胞和表達參數（IH opt.；n = 1）。 (A) 兩種方法的 VCC（實線）和活性（虛線）。 (B) 培養(yǎng)過程中的直徑。 (C) 兩個實驗隨時間的體積。 (D) 標準FB和優(yōu)化IH隨時間的滴度 (g/L)。 (E) 每種方法中 IH 和 EH（最終收獲）產生的 mAb 總量。 (F) 兩個實驗中針對指數階段（最多第六天）和穩(wěn)定階段（從第六天到結束）的 qP (pg/c/d) 。
圖 6. 標準補料分批 (FB) 工藝和優(yōu)化的中間收獲（IH opt.）在第六天以及最終收獲 (EH) 中表達的 mAb 的糖基化百分比分布。
總結
在這項研究中，開發(fā)了一種介于灌流細胞培養(yǎng)和經典 FB 培養(yǎng)之間的新型混合工藝。因此，研究了在普通 FB 培養(yǎng)過程中與 FBC 系統(tǒng) (IH) 進行完整且快速的培養(yǎng)基置換的影響。我們的結果顯示，根據 IH 的時間點，對培養(yǎng)有兩種不同的影響。在指數生長期，可以實現細胞的顯著延長增殖，從而導致更高的峰值細胞密度。相比之下，靜止期的 IH 會導致細胞增殖持續(xù)停滯，延長高細胞活性，并隨后延長工藝持續(xù)時間?？紤]到最終產品滴度沒有顯著差異，并且在后期時間點進行IH操作時的雜質/產品比率增加，因此選擇指數增長階段的 IH 進行放大?？尚行砸约靶∫?guī)模的可比性可以在放大的系統(tǒng)中得到證明。此外，通過增加罐的利用率并隨后在 IH 操作后濃縮細胞，可以在后續(xù)步驟中進一步優(yōu)化該工藝。結果顯示，與標準相比，啟用FBC 的新工藝允許每次運行的總產品產量增加 +154% mAb?？偟膩碚f，這項工作展示了一種創(chuàng)新的新方法，無需灌流細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的復雜集成即可強化常用的 FB 操作。此外，由于 IH 工藝的簡單性，可以將此應用與各種其它強化方法（例如高密度接種 FB）相結合。此外，由于 FBC 系統(tǒng)已經存在放大版本，已建立的過程應該可以完全放大到 2000 L 規(guī)模。然而，仍然需要進行生產規(guī)模（例如，2000 L）的概念驗證，這將是未來研究的重點?？偟膩碚f，提出的工作開辟了幾種新的可能性，來修改當前的 FB 工藝，以顯著提高產品產量和生產率。
原文：L.N.Reger, M.Saballus, J.Matuszczyk, et al., Boosting Productivity for Advanced Biomanufacturing by Re-Using Viable Cells. Front. Bioeng. Biotechnol.,2023.
